犬炎症性腸疾(Canine Inflammatory
Bowel Disease)
楊德威（1） 劉福安（2）
（1）中山大學生命科學學院生物防治國家重點實驗室生物醫藥中心
（2）華南農業大學獸醫學院
摘要： 本文主要以1997年至2003年期間，對全國各地發生不明原因的犬炎症性腸疾(Canine
Inflammatory Bowel Disease)病例進行分子病毒學與微生物學研究，發現犬發炎性腸疾的抗原病毒能與細菌生長過程中所產生的分泌物產生協同作用，使原本不致病的犬病毒表現為致病致死的強病毒。此外，本研究更闡明犬炎症性腸疾可以由多個協同性病毒“協同性犬呼腸孤病毒”
(Canine Synergisistic Reovirus) 、“協同性犬正粘病毒” (Canine Synergisistic Orthomyxovirus)
、“協同性犬類細小病毒感染因數” (Canine Synergisistic Sub-parvovirus) 與特定的細菌生長過程中所產生的分泌物產生協同作用而使犬只致病。
關鍵字 ：犬炎症性腸疾(Canine Inflammatory Bowel Disease) 病毒協同作用 抗生素多抗性細菌
前言 犬炎症性腸疾（CIBD）是病因不明的腸內慢性炎症性疾病，在20世紀70年代末期才被獸醫發現，但發病原因至今仍無法確定(1)。過去獸醫較為接受的兩種病因假設有：
1. 細菌感染。因為這些CIBD病例可以利用抗生素治癒，所以認為細菌是致病原因，但是至今尚無人能分離出病原菌且將其移至健康實驗犬的腸道而使其致病，所以無法證明此假設的真實性；
2. 腸道內抗原抗體反應。支持這假設的學者認為犬食了具有抗原性的食物，在腸道引發抗原抗體反應而致發炎，細胞通透性增大，有些大分子蛋白質便進入腸粘膜中而引發抗原抗體反應，使炎症反應惡化而成為惡性循環。由於德國狼犬、沙皮、洛威及純種犬較易獲得此病，發病年齡由4月齡至15歲齡均有。因此，有些學者認為此病與遺傳有關。
CIBD的症狀為：嘔吐、下痢(先急後重)糞便帶血有或粘液、體重下降、腹部脹氣、食欲下降等。病犬表現一種或多種症狀，多半有下痢，但下痢並非必定出現的症狀。
病犬的病情和犬本身的免疫力以及受損腸道的面積有關，個體間的差異較大。大腸發炎則使腸道蠕動幅度變小。小腸發炎則有嘔吐、體重下降、食欲改變及大量下痢的症狀。
漸進性CIBD的症狀為：患犬最初可能只是一個月嘔吐或下痢1次；一段時間後則增加到1周1次或1日1次，嚴重者甚至1日數次嘔吐及下痢。病程由數星期到數月不等(1)。
由於病因不明，CIBD只能靠排除其他病因來作診斷。當病犬出現嘔吐、氣脹、下痢、便血或糞便帶有上皮細胞膜、食欲減少或不食等病症，獸醫一般會檢查是否因飲食不當、食物敏感、寄生蟲、腸道阻塞、胰?或其他消化?不足、細菌或病毒感染、腸道淋巴瘤等等原因所引起；一一排除了這些致病的原因後，病犬的病情仍無法改善，則可判斷為CIBD(1)。
1 實驗目的
某些病毒在細胞裏增殖時，如果得到所需的蛋白?協同可令這些病毒得到很好的增殖量(2)。筆者在禽流感病毒與特定細菌的協同作用的研究中發現，某些細菌所產生的蛋白?可協同低致病禽流感病毒轉變為高致病的禽流感病毒(11)。CIBD是病因不明的腸內慢性炎症性疾病，在1970年代末期才被獸醫發現，但發病原因至今仍無法確定。1997年至2003年期間，本實驗室檢測的CIBD樣品中分離得到很多病原體（包括病毒及細菌），可是在動物回歸實驗中不能引起實驗動物致病。但實際上在200多個CIBD的病例中都引起犬發病及死亡。此外在多次引起病犬死亡的CIBD病例中，實驗室的基因序列分析還是找不到致病的犬病毒毒株。根據種種的證據我們有理由相信大部分的CIBD是弱病毒毒株與某些特定細菌或微生物生長過程中所產生的分泌物產生協同作用，使原本不致病的犬病毒表現為致病致死的強病毒。為此筆者發明微生物及病毒與細胞體外同體培養裝置，檢測從不同地方收集的病毒料，以圖闡明各細菌在生長過程中所產生的分泌物對各種CIBD病毒弱毒株產生的協同作用。
1.1 實驗材料
CIBD病毒株及分泌類胰蛋白?、類枯草桿菌蛋白?的原始菌株收集自全國各地多個犬場、動物診所、獸醫院等。參照文獻(3)~(10)的方法，病毒株經電子顯微鏡作型態學初步鑒定後再進行犬基因片段PCR擴增，鑒定後的犬病毒陽性毒株置液氮保存。實驗動物由德威動物醫院提供及資助。擴增各類犬病毒基因片段的PCR引物，擴增犬科動物和貓科動物病毒基因片段的PCR引物由筆者設計及保存(3)~(9)，引物合成由大連基康生物工程有限公司完成。分子生物學試劑、細菌藥敏檢測試劑及藥敏試紙由德威動物醫院提供。超靜台及其他分子病毒學、微生物學的實驗用具為本實驗室常規用品。細菌塵埃收集器為本實驗室自製產品。微生物與細胞體外同體培養裝置為本實驗室的專利發明。
1.2 方法
1.2.1. 病毒與細菌協同作用: 檢測犬病毒引物設計及其病毒的純化、病毒核酸的提取、PCR檢測及間接ELISA，菌種鑒定及菌種的抗生素抗性檢測參照文獻(9)
(10)的方法進行。對於80個CIBD樣品經PCR檢測結果為犬病毒陽性的原始病料用電子顯微鏡作病毒型態鑒定，最後挑選出來15個代表病毒株作以下實驗。
1.2.1.1
鑒定併發細菌感染對病毒感染致病性影響的方法: 將犬病毒陽性的原始病料裏的細菌作單菌落克隆，再將有代表性細菌克隆與CIBD犬病毒共同接種於以下條件的細胞培養物中，細胞培養參照文獻（11）的方法進行：
上述細菌接種於一與細胞隔離但通過孔徑不大於0.22微米微孔濾膜與細胞培養物相通的培養室中，具體步驟為：
（1） 分別將細菌接種於固體LB培養基平板，37℃培養12小時，挑取單菌落並作菌種鑒定。
（2） 分別在40個克氏細胞培養瓶中用常規的細胞培養液1640培養WCK細胞系，待WCK 達80% 融合時，接種待鑒定的20個CIBD病毒樣品；
A組： 將克隆的細菌分別接種於15個特製微型細菌培養室，再分別將15個細菌培養室放入已長有細胞的15個細胞培養瓶的培養液中，37℃培養12小時後取出細菌培養室，
繼續培養36小時。
B組： 分別接種15個CIBD病毒樣品入細胞培養瓶，于37℃培養48小時。
C組： 將分別接種了克隆的細菌的15個細菌培養室移入細胞培養瓶，于37℃培養12小時後取出細菌培養室， 繼續培養36小時。
D組： 5瓶不接種任何病原的細胞培養物作為對照組，繼續培養。觀察各組細胞培養瓶有無CPE出現。
1.2.2 細菌藥敏試驗參照文獻(10)的方法進行
1.3 判斷
根據已接種低致病性犬病毒的細胞培養物出現CPE的情況，可得到以下的鑒定結果：
a. 如果只有接種類枯草桿菌的細胞培養瓶出現CPE，而接種類胰蛋白?的細菌的細胞培養瓶和對照組不出現CPE，表明此次檢測引起犬致病及死亡的CIBD是因類枯草桿菌的混合感染所造成的；
b. 如果只有接種類胰蛋白?的細菌的細胞培養瓶出現CPE，而接種類枯草桿菌的細胞培養瓶和對照組不出現CPE，表明此次檢測引起犬致病及死亡的CIBD病毒樣品是因類胰蛋白?的細菌的混合感染所造成的；
c. 如果接種類枯草桿菌及類胰蛋白?的細菌的細胞培養瓶都出現CPE，而對照組不出現CPE，表明此次檢測引起犬致病及死亡的CIBD樣品，可以是因類枯草桿菌或類胰蛋白?的細菌混合感染所造成的；
d. 如果接種CIBD病毒的細胞培養瓶對照組出現CPE，表明此次檢測引起犬致病及死亡的CIBD病毒樣品是高致病性的CIBD病毒。
2. 結果
2.1 在本次實驗中的電子顯微鏡病毒形態初步鑒定及PCR的檢測總結，可以引起CIBD主要分為2種病毒及1種感染因數等3種病原（電鏡圖1、2、3）。
將這3種病原體命名為
(1) 協同性犬呼腸孤病毒(Canine Synergisistic Reovirus)。 由此病毒與結果2.2各種細菌產生協同作用所產生的疾病命名為協同性犬呼腸孤病毒病(Canine
Synergisistic Reovirus Inflammatory Bowel Disease)。
(2) 協同性犬正粘病毒(Canine Synergisistic Orthomyxovirus) 由此病毒與結果2.2各種細菌產生協同作用所產生的疾病命名為協同性犬正粘病毒病(Canine
Synergisistic Orthomyxovirus Inflammatory Bowel Disease)
(3) 協同性犬類細小病毒感染因數(Canine Synergisistic Sub-parvovirus) 由此病毒與結果2.2各種細菌產生協同作用所產生的疾病命名為協同性犬類細小病毒感染因數病(Canine
Synergisistic Sub-parvovirus Inflammatory Bowel Disease)
2.2 被檢測的菌種主要分為3大類：（1）為可產生類胰蛋白?的菌種。
（2）為可產生類枯草桿菌?的菌種。 （3）為可產生未知蛋白?菌種（表格1）。
表格1
菌種編號 類胰蛋白?菌種 類枯草桿菌?菌種 未知蛋白?菌種 抗生素敏感
菌種1~34 是 敏感
菌種35~46 是 不敏感
菌種47~54 是 敏感
菌種55~58 是 不敏感
菌種59~73 是 敏感
菌種74~80 是 不敏感
2.2
類胰蛋白?的菌種及類枯草桿菌?的菌種中大部分對抗生素敏感。（表格2）
表格2
2.3 A組接種了CIBD病毒弱毒株的15個WCK細胞樣品在細菌培養室兩類菌種分別產生的類胰蛋白?及類枯草桿菌?的干擾下全部產生細胞病變。
B組只接種了CIBD病毒弱毒株的15個WCK細胞樣品不產生細胞病變。
C組只接種了克隆細菌的15個WCK細胞樣品不產生細胞病變。
D組沒有接種任何病毒或細菌的5個WCK細胞樣品不產生細胞病變。
3. 討論
早在1980年Clark, S.M發現呼腸孤病毒科的某些病毒，經胰蛋白?的處理後可以增強病毒的增殖率(12)。 1996 Senne D
A與其同事發現正粘病毒科流感病毒中H5與H7亞型弱毒株的血凝素列解位點經胰蛋白?處理後，可以令此病毒在細胞上有較好的增殖(15)。1997~2003筆者發現禽流感病毒弱毒株在某些細菌所產生的?協同下，使原來不致病的病毒株變為致病強毒株(11)
(20)。目前國際獸醫組織分辨CIBD，主要採用排除發病病原的方法及動物回歸實驗。 但排除發病病原的方法對單獨不發病的病原起不了確診效果。到本實驗完成為此，國際獸醫組織尚未有將分離到的抗原在動物回歸實驗中接種實驗動物使其獨立發病。
前言中指出，現今國際獸醫組織推測CIBD其中原因是細菌感染。本次實驗中所分離到的所有菌種不能單獨發病，所分離到的所有病毒毒株也不能單獨發病。實驗表明，它們必須混合在一起時產生抗原的協同作用才能致病。表格1與表格2指出，大部分協同性菌種對抗生素敏感，菌體被抗生素所殺滅，從而終止了菌體與CIBD病毒的協同作用。由此合理地解釋了為什麼可以利用抗生素治癒CIBD，但又不能從中分離出病原菌且將其移至健康實驗犬的腸道而使其致病。
在犬的生活史中，經常會接觸到多種抗原而產生相應的抗體，這合理地解釋了為什麼血清治療法對治療CIBD有一定的療效。
本實驗的CIBD案例中，本地出生及非犬場群養德國狼犬、沙皮、洛威等純種犬不易得此病。反而，進口的德國狼犬、沙皮、洛威等純種犬較易得此病。從病理學角度看，是由於本地出生及非犬場群養的純種犬對本土抗原有較強的抵抗力，而進口的純種犬在新環境裏接觸協同抗原，從而較易得此病(17)。此外，本次實驗中並沒發現遺傳性的CIBD(17)。因此，對某些國際上有名的學者不科學推測CIBD致病原因，筆者不敢認同。
自70年代初開始，世界各地發現很多CIBD感染個案。如果犬群對新的病毒亞型缺乏抗體,很可能形成流行病。而事實上沒有發生此流行病，這可能與臨床醫生普遍喜歡使用廣譜抗生素有關。在廣譜抗生素的作用下，類胰蛋白?菌種及類枯草桿菌?菌種受到抑制而不再產生類胰蛋白?及類枯草桿菌?，子代CIBD弱病毒的子病毒因得不到類胰蛋白?及類枯草杆?的協同而終止複製。
從表格1和表格2看到，有多個對抗生素不敏感的裂解?菌種，而這些菌種所產生的裂解?卻可以產生協同發病，筆者認為這將會是很有價值的研究方向之一。這可能啟發人們去探討是否某些病毒基因的裂解位元點與菌種在生存中所分泌的裂解?產生協同作用。如果這樣，顯然處理疾病的支援療法功效將大大降低。
本次實驗中證實犬發炎性腸疾CIBD其中一個抗原為協同性犬呼腸孤病毒” (Canine Synergisistic Reovirus)它可以在類胰蛋白?菌種的協同下產生病變。其病毒增殖的理論相同於過去病毒學家為了在細胞培養中複製呼腸孤病毒科的輪狀病毒和連續傳代，通常需要用胰蛋白?處理啟動。在初代分離病毒或病毒在細胞中連續傳代時，在營養液中加入胰蛋白?常可提高病毒數倍至上百倍(2)
(12)。
Clask等（1981）建議病毒需經10�慊／mL胰蛋白?處理和元血清培養基維持，認為這對感染是必需的，胰蛋白?的活性受保存時間、不同的生產批號等因素的影響。因此，建議在接種病毒之前，應當首先測定維持液中胰蛋白?的需要量。方法是在維持液中加入不同濃度的胰蛋白?（通常為0.5、1.0、1.5………10�慊／mL），當旋轉培養中的MA-104細胞長成單層後，不接種病毒，而是換上加有胰蛋白?的維持液。最適濃度的胰蛋白?至少應有50％的細胞單層在24小時後未脫壁。一般在數小時之內，高濃度的胰蛋白?將引起細胞單層脫壁(12)。
關於胰蛋白?促進輪狀病毒感染性的機制，可能是由於對細胞的直接影響或破壞了病毒增殖的抑制物，現大多趨向認為，輪狀病毒複製方式不同于其他呼腸孤病毒，它不是通過吞飲作用進入細胞，而是通過胞漿膜直接進入胞漿，其穿人依賴於VP4。
這一過程是通過胰蛋白?作用於VP4，特異性裂解成VP5和VP8（60kD，28kD），從而使病毒變為有感染性。類似於流感病毒和副流感病毒在蛋白?作用後，囊膜的糖蛋白被消除而使其感染力活化(2)
(12) (17)。輪狀病毒也可產生蝕斑，Matsilno等（1977）報導，覆蓋瓊脂中含有胰蛋白?時，輪狀病毒可以形成蝕斑(13)。
過去某些學者認為胰?或其他消化?不足是引發犬發炎性腸疾的原因之一(1)，本次實驗中證實犬發炎性腸疾必需有某些?的協同才能發病。
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(20) Waisees Yeung Avian pathogenicity databanks 1997~2003
附錄: 細菌和細胞同體培養裝置
一種細胞體外同體培養裝置，其特徵是該裝置由細胞培養瓶1和細菌培養室3構成，細菌培養室置於細胞培養瓶中；該細菌培養室為一封閉結構，其壁上有一可與細胞培養瓶內的培養液相通的孔徑不大於0.22微米的微孔濾膜34。
按照專利要求4所述的裝置，其特徵是所述細菌培養室3是由a壁31與b壁32之間夾一密封圈33，並有若干固定螺絲35固定構成的封閉結構，其b壁上有開口36，該開口有一使細菌不能通過但其分泌的?和細胞培養瓶內的培養液可通過的孔徑不大於0.22微米的微孔濾膜34封閉。
按照專利要求5所述的裝置，其特徵是所述細菌培養室的a壁31、b壁32和固定螺絲35可用不銹鋼或無毒耐高溫塑膠加工製成，密封圈33可用無毒耐高溫橡膠或塑膠做成。提純後的病毒經套式PCR檢測（方法參照文獻2、5、6、7、8、9、10方法進行）。
電郵 / Email : waisees@hotmail.com